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进行引物设计：首先先选上游前20个碱基，点击“Primers”→“addprimer”，在弹出的选项框中选择“TOPstrand”更改上游primer的名字以及添加酶切位点序列（百度或用snapgene软件打开载体序列均可查找到内切酶对应的切割序列）和保护碱基的序列。-生命科学软件然后点击“Addprimertotemplate”选择下游20个碱基，点击“Edit”→“copybottomstrand”，选择“5’→3’”-生命科学软件点击“Primers”→“Addprimer”，在弹出的选项框中点击右上角的×，直接关闭。生命科学软件公司介绍。山东GraphPad Prism生命科学软件下载

在该序列5’端上添加数个碱基作为保护碱基。点击完成。-生命科学软件△下游引物设计相同，不再赘述。2.突变引物绘制：在目的基因上截取一小段包含要突变位点的序列，点击Primers→Addprimers，为该引物命名，在5’序列突变位点的三个碱基画黑，点击Insertions，选择突变成的氨基酸，点击Insert。即可获得该突变引物，点击ReverseComplement，可获得反向引物。-生命科学软件模拟标准限制性克隆1.打开**入片段的质粒图谱，选择合适的两个酶切位点，如HindIII和ApaI。数据可视化处理生命科学软件下载生命科学软件有什么特点和功能分析。

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点击序列可以查看区域内的可用酶切位点。我们可以看到所有酶切位点中，在我们实验室有的酶又不会把基因切碎的酶*有Nde1,EcoR1,而Pst1不在载体的酶切位点上，所以排除。这里我们选择双酶切法，所以选择了Nde1,EcoR1两个位点，其中Nde1在前，EcoR1在后-生命科学软件查看可以插入的酶切位点后，返回到目的基因的DNA文件。点击primerforward序列，点击Insertions,***列绿色方框不要管，这个方框是用来添加氨基酸，在构建载体过程不需要调整。把第二列红色方框改成***个酶切位点基因Nde1,然后点击insert.并在前面添加G或者C为保护碱基（也可以网络查询适用的保护碱基）。-生命科学软件。生命科学软件 - 专业软件代理商。

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